Интеркалирующий краситель SYBR Green I для ПЦР-РВ
SYBR Green I – интеркалирующий краситель, специфичный к двухцепочечной ДНК. Раствор оптимизирован для применения в ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Краситель рекомендуется использовать как 50X раствор, при оптимизации условий ПЦР допускается применять в диапазоне от 25Х до 100Х. Входящий в комплект раствор 100% DMSO можно добавлять вплоть до конечного содержания 5%.
Спектральные свойства: длина волны возбуждения – 497 нм, флуоресценции – 521 нм
Принцип действия
SYBR Green I – интеркалирующий краситель, интенсивность флуоресценции которого увеличивается на несколько порядков при встраивании в двухцепочечную ДНК. Поэтому в ходе ПЦР при накоплении продукта амплификации сигнал флуоресценции возрастает, образуя кривую сигмоидной формы (рис. А).
Амплификация фрагмента геномной ДНК человека (200 п.о.)
Использованы разведения геномной ДНК человека с шагом в 4 раза (от 125 нг/реакцию до 7.5 пг/реакцию)
А: кривые амплификации;
Б: кривые плавления ПЦР-продуктов.
Поскольку SYBR Green I связывается с любой двухцепочечной ДНК, увеличение флуоресценции в ПЦР может быть связано с накоплением как специфического продукта, так и неспецифического (димеры праймеров, неспецифический отжиг праймеров). В реакции без матрицы уровень флуоресценции может превышать пороговый уровень не вследствие контаминации матрицей, а из-за образования димеров праймеров. Для получения корректных результатов после окончания реакции необходимо дополнительно проанализировать результат ПЦР с помощью построения так называемой "кривой плавления" (melt curve).
Анализ кривой плавления
Кривая плавления должна быть построена в диапазоне от температуры на 5–10 °C ниже температуры плавления праймера (Tm) до температуры полной денатурации (примерно 95 °C). Обычно кривая строится после проведения ПЦР. Анализировать кривую удобнее всего в координатах -d(RFU)/dT от t° (обратная зависимость скорости от температуры, рис. Б).
Совместимость с приборами
SYBR Green I совместим с любыми приборами для проведения амплификации в режиме реального времени.
Совместимость с компонентами ПЦР
50Х SYBR Green I совместим с референсным красителем ROX, с любыми неокрашенными реакционными буферами, а также с полимеразами любого типа, вне зависимости от наличия 5’ или 3’ экзонуклеазной активности. 50Х SYBR Green I может использоваться в реакциях с добавлением dUTP и урацилгликозилазы. При использовании рекомендуется применять полимеразы с "горячим стартом".
| Название | Инструкция | Кат. # | Количество | Цена, руб. |
|---|---|---|---|---|
| 50Х SYBR Green I для ПЦР-РВ | PB025S | 200 реакций по 25 мкл | 1 700 | |
| PB025M | 1000 реакций по 25 мкл | 7 000 |
Число циклов замораживания/размораживания: не более 20.
Транспортировка и хранение: –20 °C в темноте.
Срок хранения: при соблюдении условий хранения и транспортировки 1 год со дня поставки.