Реактивы для синтеза кДНК
Синтез первой цепи кДНК
Синтез одноцепочечной комплементарной ДНК на матрице РНК возможен благодаря работе РНК-зависимых ДНК-полимераз, которые также называют обратные транскриптазы или ревертазы. Обратные транскриптазы обнаружены у эукариот, прокариот и ретровирусов.
Ключевая ценность метода обратной транскрипции заключается в том, что он позволяет изучать популяцию РНК в клетке путем перевода ее в более стабильную форму в виде ДНК. Рутинные методы работы с ДНК (ПЦР, ПЦР-РВ, клонирование, секвенирование и др.) позволяют исследовать экспрессию целевых генов, определять нуклеотидные последовательности генов, исследовать сплайсинг, регуляцию работы генов и многие другие процессы, в которых ключевая роль отведена РНК.
Обратная транскриптаза MMLV — ревертаза дикого типа вируса лейкемии мышей MMLV, продукт гена pol MMLV, обладает слабой активностью РНКазы H.
Обратные транскриптазы Mint и Magnus — модифицированные ревертазы MMLV, обладающие повышенной термостабильностью и лишенные активности РНКазы H.
Для подбора обратной транскриптазы, подходящей для вашего исследования, воспользуйтесь таблицей:
| Название | Терминальная трансферазная активность | Длина кДНК | Время реакции | Инструкция | Кат. # | Кол-во реакций | Цена, руб. |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Обратная транскриптаза MMLV | — | до 8 т.п.о. | 60 мин | SK022S | 100–200 | 7 700 | |
| SK022L | 500–1000 | 33 900 | |||||
| Набор MMLV RT | SK021 | 50 | 6 200 | ||||
| Обратная транскриптаза Mint | ✔ | до 8 т.п.о. | 60 мин | SK003 | 50–100 | 18 800 | |
| Magnus | — | до 12 т.п.о. | 15 мин | SK006S | 50–100 | 19 100 | |
| SK006M | 250–500 | 77 200 |
Обратная транскрипция и амплификация кДНК
Одноцепочечная кДНК, растворенная в реакционной смеси, сохраняется недолго: ее желательно использовать в дальнейшей работе как можно быстрее. В зависимости от цели и возможностей исследователя существуют различные подходы для получения амплифицированной кДНК:
- синтез первой цепи кДНК и амплификация интересующего фрагмента кДНК в одной пробирке (одна стадия);
- синтез первой цепи кДНК, затем амплификация интересующего фрагмента в другой пробирке (две стадии);
- синтез первой цепи, затем амплификация кДНК целиком - с созданием библиотеки кДНК
(две или три стадии, в зависимости от дальнейшего применения библиотеки).
Синтез первой цепи и создание полноразмерных библиотек кДНК
| Название | Приготовление полноразмерных библиотек | Направленное клонирование библиотек | Тип РНК-матрицы | Инструкция | Кат. # | Кол-во реакций | Цена, руб. |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Набор для синтеза кДНК Mint | ✔ | — | поли(А) или тотальная РНК | SK001 | 20 | 18 200 | |
| Набор для синтеза кДНК Mint-2 | ✔ | ✔ | поли(А) или тотальная РНК | SK005 | 20 | 19 800 |
Синтез первой цепи и амплификация "в одной пробирке"
| Название | Способ детекции | Инструкция | Кат. # | Кол-во реакций | Цена, руб. |
|---|---|---|---|---|---|
| Набор OneTube RT-PCR TaqMan | Флуоресцентные зонды типа TaqMan | SK031S | 100 | 10 800 | |
| SK031M | 500 | 50 900 | |||
| Набор OneTube RT-PCR SYBR | Интеркалирующий краситель SYBR Green I (входит в состав смеси) | SK032S | 100 | 10 800 | |
| SK032M | 500 | 50 900 | |||
| Смесь OneTube RT-PCRmix | Флуоресцентные зонды типа TaqMan или интеркалирующие красители | SK101S | 100 | 9 500 | |
| SK101M | 500 | 46 100 |
Связанные продукты
| Название | Описание | Инструкция | Кат. # | Количество | Цена, руб. |
|---|---|---|---|---|---|
| Геномная ДНК | |||||
| Геномная ДНК человека | Геномная ДНК из клеточной линии человека Raji, 100 мкг/мл. | NA101 | 10 мкг, 100 мкл | 4 000 | |
| Фрагментированная геномная ДНК человека | Фрагментированная геномная ДНК из клеточной линии человека Raji, 100 мкг/мл. | NA102 | 10 мкг, 100 мкл | 4 900 | |
| Геномная ДНК крысы | Геномная ДНК крысы из клеточной линии C6, 100 мкг/мл. | NA201 | 10 мкг, 100 мкл | 4 000 | |
| dNTP | |||||
| Смесь dNTP (10 мМ каждого) | Смесь dNTP предназначена для использования в ПЦР, реакциях обратной транскрипции и любых других приложениях, требующих синтеза ДНК | PB006S | 200 мкл, 2 мкмоль | 850 | |
| PB006L | 2 мл (10 x 200 мкл), 20 мкмоль | 6 600 | |||
| Смесь dNTP (2 мМ каждого) | PB032 | 5 мл (5 х 1 мл), 10 мкмоль | 4 850 | ||
| Набор dNTP (100 мМ) | Набор из 4-х пробирок высокоочищенных дезоксинуклеотидов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Концентрация каждого — 100 мМ | PB033 | 4 х 250 мкл, 25 мкмоль каждого | 5 500 | |
| Раствор dUTP (100 мМ) New | Для использования в ферментативных реакциях синтеза ДНК, где требуется полная или частичная замена dTTP (в том числе для контроля контаминации реакции) | PB034 | 100 мкл, 10 мкмоль | 700 | |
| Вода | |||||
| Вода деионизированная, свободная от нуклеаз | Вода высокой степени очистки | PB207S | 7.5 мл (5 х 1.5 мл) | 450 | |
| PB207M | 50 мл | 2 700 | |||
| PB207L | 1 л | 48 000 | |||
| Буферные растворы | |||||
| 4X Gel Loading Dye, Blue буфер | Буфер для нанесения образцов РНК и ДНК на агарозный гель | PB020 | 7.5 мл (5 x 1.5 мл) | 800 | |
| Буфер для разведения ДНК | Буфер для разведения ДНК, не содержит нуклеаз | PB021 | 7.5 мл (5 x 1.5 мл) | 750 | |
| Oligo(dT)15 праймер | Олиго(dT)15 праймер (20 мкМ) для синтеза первой цепи тотальной кДНК | SB001 | 250 мкл (5 x 50 мкл), 5 нмоль | 700 | |
| Random(dN)10 праймер | Случайный декануклеотидный праймер (20 мкМ) для синтеза первой цепи тотальной кДНК | SB002 | 250 мкл (5 x 50 мкл), 5 нмоль | 700 | |
| Буфер для синтеза первой цепи кДНК | 5X буфер для синтеза первой цепи кДНК. Для ревертаз MMLV, Mint и Magnus | SB003 | 1.8 мл | 700 | |
| Раствор DTT (дитиотреитола) | Раствор DTT (концентрация 20 мМ) | SB004 | 1 мл | 700 | |
| Буфер для разведения и хранения MMLV ревертазы | Буфер для разведения и хранения MMLV ревертазы | SB005 | 2.5 мл (5 x 0.5 мл) | 700 | |
| Ферменты | |||||
| ДНКаза Е | Термостойкая эндонуклеаза, разрушающая ДНК до одноцепочечных олигонуклеотидов | EK007S | 100 е.а. | 2 800 | |
| EK007M | 500 е.а. | 11 800 | |||
| Реактивы для фиксации, выделения и очистки РНК | |||||
| Фиксатор IntactRNA | Фиксатор для стабилизации клеточной РНК в тканях и клеточных культурах (аналог RNAlater) | BC031 | 100 фиксаций по 100 мг ткани | 5 400 | |
| Реагент ExtractRNA | Реагент для выделения суммарной РНК из биологических образцов (аналог TRIzol) | BC032 | 100 выделений из 100 мг ткани | 7 250 | |
| CleanRNA Standard | Набор для очистки препаратов суммарной РНК | BC033S | 25 реакций | 8 100 | |
| BC033M | 100 реакций | 29 900 | |||
| Реактивы для амплификации концевых фрагментов кДНК (RACE) | |||||
| Набор реактивов Mint RACE cDNA amplification set | Набор, включающий все необходимые реактивы для синтеза кДНК на основе тотальной или поли(А) РНК и последующей амплификации 5'- и 3'-концевых фрагментов целевых транскриптов | SKS03 | 20 реакций синтеза кДНК + 200 реакций амплификации объемом 25 мкл + 25 реакций лигирования | 33 100 | |
| Набор праймеров Mint RACE primer set | Набор адаптерных смесей (праймеров) для быстрой амплификации концевых фрагментов целевых транскриптов с кДНК-матрицы, приготовленной с помощью набора для синтеза кДНК Mint kit | SK004 | 200 реакций объемом 25 мкл | 5 100 | |
| Реактивы для нормализации кДНК | |||||
| Дуплекс-специфическая нуклеаза (ДСН) | Лиофилизированная дуплекс-специфическая нуклеаза для расщепления двухцепочечной ДНК, а также ДНК в составе гибридного гетеродуплекса ДНК-РНК | EA001 | 50 ед. Куница | 30 000 | |
| EA002 | 100 ед. Куница | 42 400 | |||
| EA003 | 10 ед. Куница | 9 900 | |||
| Набор реактивов для нормализации кДНК "Trimmer-2" | Набор реактивов для нормализации двухцепочечной кДНК | NK003 | 100 реакций | 46 800 | |