Оценка степени фрагментации образцов ДНК

Набор QuantumDNA-Set (QS004) позволяет определить степень фрагментации ДНК по соотношению эффективных концентраций короткого и длинного фрагментов. Этот параметр определяет качество образца и возможность использования его для различных приложений.

Соотношение концентраций короткого и длинного фрагментов заданной длины (индекс деградации) позволяет определить степень фрагментации ДНК:

Индекс деградации C91/C211	Индекс деградации C91/C156 или C156/C211	Интерпретация результата
≤ 1,5	≤ 1,5	ДНК не фрагментирована
1,5-9	1,5-3	ДНК слабо или умеренно фрагментирована
> 9 или значение C211 не определяется	> 3	ДНК существенно фрагментирована

Частично фрагментированная геномная ДНК (средний размер фрагментов 500-1500 п.о.) амплифицируется эффективнее, чем нефрагментированная.

Если геномная ДНК не фрагментирована, концентрация, измеренная для фрагмента длиной 211 п.о., будет сопоставима с концентрацией фрагмента длиной 91 п.о., индекс деградации ≈ 1.

Однако если ДНК фрагментирована настолько, что средний размер фрагментов меньше, чем размер выбранного ампликона, эффективность ПЦР резко падает.

Деградация чаще всего наблюдается в образцах ДНК, выделенных из:
    - тканей, фиксированных формалином и заключенных в парафиновые блоки (FFPE);
    - тканей, хранившихся без фиксации в течение долгого времени.

Пример анализа образца ДНК, выделенного из FFPE-блока

Образец ДНК, выделенный из FFPE блока, был проанализирован на капиллярном электрофорезе (Agilent 2200 TapeStation), определены абсолютная концентрация ДНК и распределение молекул ДНК по размеру.

	Электрофореграмма в капилляре, пик в низкомолекулярной области соответствует ДНК маркеру 100 п.о. (Agilent 2200 TapeStation).

Результаты анализа показали удовлетворительное качество образца для ПЦР: средний размер фрагментов - 255 п.о., концентрация ДНК определена как 20 нг/мкл.

С этим образцом была проведена аналитическая реакция с ампликоном длиной 200 п.о., протокол которой предполагает добавление не менее 1 нг ДНК. При добавлении 1 мкл данного образца (абсолютная концентрация 20 нг/мкл) реакция не развивается (рис. А, красная кривая).

Анализ того же образца с применением набора QuantumDNA-Set показывает, что эффективная концентрация ДНК падает с увеличением длины ампликона (рис. Б).

А - Кривые накопления продукта ПЦР в аналитической реакции (ген EGFR, экзон 18). Синяя линия - реакции со стандартом ДНК 1 нг; красная - с исследуемым образцом. Б - Кривые накопления продукта ПЦР при анализе образца ДНК набором QuantumDNA-Set. Синяя линия - стандарты ДНК (25, 3.5 и 0.5 нг/мкл), зеленая - анализ образца на ампликон длиной 91 п.о., оранжевая - на ампликон 156 п.о., красная - на ампликон 211 п.о.

Рассчитанные эффективные концентрации для данного образца составили:
Для ампликона длиной 91 п.о. - 0.5 нг/мкл;
Для ампликона 156 п.о. - 0.07 нг/мкл;
Для ампликона 211 п.о. концентрация ДНК не определяется.

Индекс деградации C₉₁/C₁₅₆ для этого образца составляет более 7, что свидетельствует о сильной деградации ДНК.

Таким образом, несмотря на то, что абсолютная концентрация ДНК в образце удовлетворяет условиям анализа, его эффективная концентрация ДНК недостаточна для амплификации фрагментов длиной более 160 п.о.

Прогнозирование концентрации ДНК с размером ампликона 50-500 п.о.

При умеренной деградации ДНК в образце индекс деградации в диапазоне 1.5-9 (для парs 91/211) или около 1.5-3 (для пар 91/156 или 156/211), можно предсказать концентрацию фрагментов другой длины (до 500 п.о.) по следующей формуле, основанной на распределении Пуассона (Deagle et al., 2006):

Например, если концентрация образца по фрагменту длиной 91 п.о. равна 10 нг/мкл, а по фрагменту 211 п.о. равна 5 нг/мкл, то концентрация для фрагмента длиной 300 п.о. предположительно составит:

   КАЛЬQЛЯТОР