Оценка степени фрагментации образцов ДНК
Набор QuantumDNA-Set позволяет определить степень фрагментации ДНК по соотношению эффективных концентраций короткого и длинного фрагментов. Этот параметр определяет качество образца и возможность использования его для различных приложений.
Соотношение концентраций короткого и длинного фрагментов заданной длины (индекс деградации) позволяет определить степень фрагментации ДНК:
Индекс деградации C91/C211 | Индекс деградации C91/C156 или C156/C211 | Интерпретация результата |
|---|---|---|
≤ 1,5 | ≤ 1,5 | ДНК не фрагментирована |
1,5-9 | 1,5-3 | ДНК слабо или умеренно фрагментирована |
> 9 или значение C211 не определяется | > 3 | ДНК существенно фрагментирована |
Частично фрагментированная геномная ДНК (средний размер фрагментов 500-1500 п.о.) амплифицируется эффективнее, чем нефрагментированная.
Если геномная ДНК не фрагментирована, концентрация, измеренная для фрагмента длиной 211 п.о., будет сопоставима с концентрацией фрагмента длиной 91 п.о., индекс деградации ≈ 1.
Однако если ДНК фрагментирована настолько, что средний размер фрагментов меньше, чем размер выбранного ампликона, эффективность ПЦР резко падает.
Деградация чаще всего наблюдается в образцах ДНК, выделенных из:
тканей, фиксированных формалином и заключенных в парафиновые блоки (FFPE);
тканей, хранившихся без фиксации в течение долгого времени.
Пример анализа образца ДНК, выделенного из FFPE-блока
Образец ДНК, выделенный из FFPE блока, был проанализирован на капиллярном электрофорезе (Agilent 2200 TapeStation), определены абсолютная концентрация ДНК и распределение молекул ДНК по размеру.
Электрофореграмма в капилляре, пик в низкомолекулярной области соответствует ДНК маркеру 100 п.о. (Agilent 2200 TapeStation).
Результаты анализа показали удовлетворительное качество образца для ПЦР: средний размер фрагментов - 255 п.о., концентрация ДНК определена как 20 нг/мкл.
С этим образцом была проведена аналитическая реакция с ампликоном длиной 200 п.о., протокол которой предполагает добавление не менее 1 нг ДНК. При добавлении 1 мкл данного образца (абсолютная концентрация 20 нг/мкл) реакция не развивается (рис. А, красная кривая).
Анализ того же образца с применением набора QuantumDNA-Set показывает, что эффективная концентрация ДНК падает с увеличением длины ампликона (рис. Б).
А - Кривые накопления продукта ПЦР в аналитической реакции (ген EGFR, экзон 18).
Синяя линия - реакции со стандартом ДНК 1 нг; красная - с исследуемым образцом.
Б - Кривые накопления продукта ПЦР при анализе образца ДНК набором QuantumDNA-Set.
Синяя линия - стандарты ДНК (25, 3.5 и 0.5 нг/мкл), зеленая - анализ образца на ампликон длиной 91 п.о., оранжевая - на ампликон 156 п.о.,
красная - на ампликон 211 п.о.
Рассчитанные эффективные концентрации для данного образца составили:
Для ампликона длиной 91 п.о. - 0.5 нг/мкл;
Для ампликона 156 п.о. - 0.07 нг/мкл;
Для ампликона 211 п.о. концентрация ДНК не определяется.
Индекс деградации C91/C156 для этого образца составляет более 7, что свидетельствует о сильной деградации ДНК.
Таким образом, несмотря на то, что абсолютная концентрация ДНК в образце удовлетворяет условиям анализа, его эффективная концентрация ДНК недостаточна для амплификации фрагментов длиной более 160 п.о.
Прогнозирование концентрации ДНК с размером ампликона 50-500 п.о.
При умеренной деградации ДНК в образце индекс деградации в диапазоне 1.5-9 (для парs 91/211) или около 1.5-3 (для пар 91/156 или 156/211), можно предсказать концентрацию фрагментов другой длины (до 500 п.о.) по следующей формуле, основанной на распределении Пуассона (Deagle et al., 2006):
l - lкороткий | ||||
Cl = Cкороткий | Cкороткий | lкороткий - lдлинный | ||
Cдлинный | ||||
Например, если концентрация образца по фрагменту длиной 91 п.о. равна 10 нг/мкл, а по фрагменту 211 п.о. равна 5 нг/мкл, то концентрация для фрагмента длиной 300 п.о. предположительно составит:
300 - 91 | |||||
C300 = 10 | 10 | 91 - 211 | ≈ 3 нг/мкл | ||
5 | |||||
КАЛЬКУЛЯТОР
Введите значения концентраций, полученные с помощью набора QuantumDNA-Set. Укажите длину фрагмента, для которого вы хотите рассчитать концентрацию.
Индекс деградации: 2.00
Концентрация для ампликона длиной 300 п.о.: ~2.99 нг/мкл
Калькулятор позволяет прогнозировать концентрацию ампликонов длиной от 50 до 500 п.о. для умеренно деградированных образцов.
Умеренно деградированные образцы — такие образцы, для которых индекс деградации составляет от 1.5 до 9 (для пары 91/211) или от 1.5 до 3 (для пар 156/211 и 91/156).
Индекс деградации — это соотношение концентраций короткого и длинного фрагмента, например, С91/С211.
Список статей
- Deagle BE, Eveson JP, Jarman SN.
Quantification of damage in DNA recovered from highly degraded samples - a case study on DNA in faeces.
Frontiers in Zoology 2006 Aug 16;3:11
pmid: 16911807 doi: 10.1186/1742-9994-3-11