Определение пригодности образца для ПЦР
Определение производится путем оценки эффективной концентрации фрагментов ДНК соответствующей длины.
Эффективная концентрация - параметр количественной и качественной оценки ДНК, учитывающий концентрацию только тех фрагментов ДНК, которые пригодны для амплификации в ПЦР.
Значение эффективной концентрации может
существенно отличаться от значений абсолютной концентрации, полученных методами, основанными на оптической
спектрофотометрии
или спектрофлуориметрии, поскольку последние не учитывают возможную фрагментацию молекул, химическую
деградацию или модификацию,
а также наличие ингибиторов ПЦР. |
Определение эффективной концентрации проводится методом количественной ПЦР-РВ с использованием образцов геномной ДНК человека с известной концентрацией (стандартов). Для амплификации используются специфические праймеры на однокопийный участок в гене человека GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase). Накопление продуктов амплификации детектируется с использованием флуоресцентно-меченого зонда типа Taqman в режиме реального времени (см. схему).
 | Схема расположения праймеров и зонда. |
После проведения амплификации (рис. А) стандартное ПО строит калибровочный график (рис. Б) по которому автоматически определяется эффективная концентрация ДНК в исследуемых образцах (рис. Г). Внутренний контроль, включенный в каждую реакцию, позволяет выявить образцы, содержащие ингибиторы ПЦР (рис. В).
 |  | А - кривые накопления ПЦР-продукта в канале FAM (измерительная реакция).Синяя линия - стандарты ДНК и контроль без матрицы; красная - исследуемый образец. Б - калибровочный график на основе стандартов ДНК (отмечены кружками).Крестик - проекция Cq исследуемого образца на калибровочную кривую, по которой рассчитывается его концентрация. В - кривые накопления ПЦР-продукта в канале HEX (внутренний контроль).Зеленая линия - внутренний контроль в реакциях со стандартами ДНК и контролем без матрицы; красная - внутренний контроль в реакции с исследуемым образцом. Г - таблица с вычисленными значениями эффективных концентраций. |
|---|---|---|
 |  |
