Evrogen

Фосфорилирование и кинирование

В стандартных протоколах клонирования 5′-концевая фосфатная группа необходима для успешной реакции лигирования. В данном случае вектор или ПЦР-продукт должны нести 5′-концевую фосфатную группу.

Схема лигирования вектора и ПЦР-продукта в зависимости от наличия 5′-концевых фосфатных групп.

а) лигирование не проходит при отсутствии 5′-концевых фосфатных групп в векторе и ПЦР-продукте;
б, в) лигирование проходит при наличии 5′-концевых фосфатных групп в векторе или ПЦР-продукте.
5′-фосфатные группы в ПЦР-продукте возникают либо при обработке ПЦР-продукта рестриктазами
(при наличии соответствующих сайтов рестрикции), либо при наработке продукта с помощью 5′-фосфорилированных праймеров.

При заказе олигонуклеотидов через онлайн-форму доступны следующие варианты модификации:

  • синтез олигонуклеотида с фосфатной группой на 5′- и/или 3′-конце;

  • ферментативное кинирование.

Фосфорилирование олигонуклеотидов

При обработке плазмидного вектора или ПЦР-продуктов, несущих сайты рестрикции, соответствующими рестриктазами, фосфорилирование не нужно, т.к. продукты рестрикции уже содержат 5′-концевые фосфатные группы.
Фосфорилирование олигонуклеотидов необходимо при:

  • лигировании ПЦР-продуктов, необработанных рестриктазой, в дефосфорилированный вектор;

  • лигировании адаптерных последовательностей к ПЦР-продуктам;

  • проведении лигазной цепной реакции.

Как заказать фосфорилирование олигонуклеотидов

Опция «Phosphate» предполагает модификацию олигонуклеотида фосфатной группой на 5′- и/или 3′-конце в процессе синтеза. После импорта в Форму II нажмите на последовательность олигонуклеотида:

Строка раскроется для редактирования. Откройте список «5′» или «3′» слева или справа от последовательности — в зависимости от того, на каком конце нужна модификация:

В списке выберите «Phosphate» (можно начать набирать название — список сократится):

Теперь модификация отображается вместе с последовательностью, готовой к заказу:

Фосфатная модификация может быть установлена как на 5′-, так и на 3′-конце (в т.ч. одновременно). Нажмите «Сохранить» — цена пересчитается в строке:

Кинирование олигонуклеотидов

Ферментативное кинирование — это присоединение фосфатной группы к 5′-концу с помощью T4 полинуклеотидкиназы.
Результатом заказа олигонуклеотида с опцией "кинирование" является два продукта:

  • кинированный олигонуклеотид (5′-фосфорилированный праймер, поставляется в объеме 20 мкл 50 мкМ раствора);

  • основной олигонуклеотид (без изменений, поставляется в виде раствора с концентрацией 100 мкМ / 200 мкМ или 1 мМ, в зависимости от шкалы синтеза).

Как заказать кинирование олигонуклеотидов

Для оформления заказа на кинированный праймер установите галочку в колонке «Кинирование» Формы II: