Фосфорилирование и кинирование

В стандартных протоколах клонирования 5’-концевая фосфатная группа необходима для успешной реакции лигирования. В данном случае вектор или ПЦР-продукт должны нести 5’-концевую фосфатную группу.

Рисунок 1 а) лигирование не проходит при отсутствии 5’-концевых фосфатных групп в векторе и ПЦР-продукте; б, в) лигирование проходит при наличии 5’-концевых фосфатных групп в векторе или ПЦР-продукте. 5’-фосфатные группы в ПЦР-продукте возникают либо при обработке ПЦР-продукта рестриктазами (при наличии соответствующих сайтов рестрикции), либо при наработке продукта с помощью 5’-фосфорилированных праймеров.

При заказе олигонуклеотидов через онлайн форму, доступны следующие варианты модификации:
– синтез олигонуклеотида с фосфатной группой на 5’- и/или 3’-конце;
– ферментативное кинирование.

Фосфорилирование олигонуклеотидов

При обработке плазмидного вектора или ПЦР-продуктов, несущих сайты рестрикции, соответствующими рестриктазами, фосфорилирование не нужно, т.к. продукты рестрикции уже содержат 5’-концевые фосфатные группы.
Фосфорилирование олигонуклеотидов необходимо при:
– лигировании ПЦР-продуктов, необработанных рестриктазой, в дефосфорилированный вектор;
– лигировании адаптерных последовательностей к ПЦР-продуктам;
– проведении лигазной цепной реакции.

Опция /Phosphate/ предполагает модификацию олигонуклеотида фосфатной группой с 5'- и/или 3’-конца в процессе синтеза. При заказе олигонуклеотида, модифицированного в процессе синтеза, после экспорта в «Форму II», нажмите на последовательность:

В открывшемся окне нажмите на «5’-мод» или «3’-мод» в зависимости от того, на каком конце нужна модификация:

В выпадающем меню выберите «/Phosphate/»:

Теперь модификация отображается вместе с последовательностью, готовой к заказу:

Фосфатная модификация может быть установлена как на 5’-, так и 3’-конце (в т.ч. одновременно):

Кинирование олигонуклеотидов

Ферментативное кинирование — это присоединение фосфатной группы к 5'-концу с помощью T4 полинуклеотидкиназы.
Результатом заказа олигонуклеотида с опцией "кинирование" является два продукта:
– кинированный олигонуклеотид (5'-фосфорилированный праймер, поставляется в объеме 20 мкл 50 мкМ раствора);
– основной олигонуклеотид (без изменений, поставляется в виде раствора с концентрацией 100 мкМ / 200 мкМ или 1 мМ, в зависимости от шкалы синтеза).

Для оформления заказа на кинированный праймер, установите галочку в соответствующем окне «Формы II»:

Пожалуйста, обратите внимание: кинирование или внесение фосфатной группы при синтезе невозможны, если при заказе на соответствующих концах праймера были указаны другие модификации.