Требования к предоставляемым материалам и образцам

Общие требования

• Не требуется добавления к образцам этилового спирта. Образцы также не нужно высушивать.
• Образцы и праймеры могут быть предоставлены в любых микроцентрифужных пробирках. По возможности используйте четкие короткие названия для подписи пробирок. Кроме этого, на пробирки могут быть нанесены цифры в том порядке, как матрица встречается в заявке.
• Пожалуйста, не дублируйте матрицу и праймеры, если вам нужно провести несколько раундов секвенирования.
• Просим не присылать слишком концентрированные образцы в меньшем объеме, чем указано в правилах. Перед постановкой секвенирования мы проверяем концентрацию образцов с помощью агарозного электрофореза и наносим 1 мкл матрицы. При предоставлении 1–2 мкл очень концентрированного образца весь образец целиком может быть использован для постановки электрофореза.
• Мы советуем проверять образцы перед отправкой с помощью электрофореза. Ваш образец должен иметь четкую полосу, без примесей других продуктов, праймер-димеров и шмера. На картинке представлены типичные варианты для плазмид и ПЦР-фрагментов. Использован маркер длин DNA Ladder 1 kb (кат. # NL001), 1% агароза в TAE буфере. Нанесение на дорожку: 1 мкл образца и 2 мкл маркера ДНК 1 kb.

Праймеры

• Праймеры к образцам добавлять не нужно.
• Температура отжига праймера должна находиться в интервале 58–62°С. Праймер не должен образовывать гомодимеры. При наработке ПЦР-фрагментов следует подбирать праймеры так, чтобы они не имели как гомодимеров, так и гетеродимеров. Вы можете использовать любую программу для проверки способности образовывать димеры.
• При подборе праймера важно учитывать специфичность 3’-конца праймера к матрице. Рекомендуется подбирать праймеры так, чтобы последние 6 букв с 3’-конца специфически отжигались только в одном месте, однако это не обязательное требование и зависит от других характеристик праймера.
• Концентрация праймеров для сиквенса — 5 пикомоль/мкл (5мкМ), на один сиквенс требуется 5 мкл раствора праймера. Если вы хотите предоставить праймеры в другой концентрации, укажите, пожалуйста, в графе “примечание” объем праймера в пробирке для корректного разведения его до 5 пикомоль/мкл.
• Для секвенирования нельзя использовать флуоресцентномеченые праймеры, рандомные праймеры и праймеры с вырожденными буквами, которые приводят к множественной посадке на матрицу.
• Праймеры, использованные для наработки ПЦР-фрагмента могут быть использованы и для секвенирования. Напишите, пожалуйста, в графе “примечание”, использовались ли данные праймеры для наработки матрицы.
• Если вам нужно получить результаты секвенирования с нескольких праймеров, предоставьте, пожалуйста, каждый праймер в отдельной пробирке.
• Если вы предоставляете специфические праймеры для секвенирования, укажите, пожалуйста, их нуклеотидные последовательности в соответствующей графе.
• Если у вас нет нужных праймеров, вы можете заказать любой праймер для секвенирования через электронную форму для секвенирования. Праймеры, заказанные в нашей компании, вы можете забрать после проведения секвенирования.
• Мы также располагаем коллекцией стандартных праймеров для часто используемых матриц. Пользование праймерами из этой коллекции — бесплатная услуга.

Плазмиды

• Для постановки одной реакции секвенирования необходимо не менее 6 мкл раствора очищенной плазмиды с минимальной концентрацией 50 нг/мкл для плазмиды длиной 3-5 т.п.о. 100 нг/мкл для плазмиды длиной 6-9 т.п.о., 150-200 нг/мкл для плазмид 10-16 т.п.о. Мы рекомендуем производить наработку ПЦР-фрагмента для матриц более 16 т.п.о. Однако если вам по каким-то причинам необходимо прямое секвенирование с матрицы большего размера, пожалуйста, напишите нам предварительно на почту sequence@evrogen.ru для обсуждения деталей заказа.
• При выделении и очистке плазмид для секвенирования рекомендуем использовать протокол, приведенный на нашем сайте, воспользоваться коммерческими наборами реактивов для выделения плазмид или заказать выделение плазмидной ДНК из культуры клеток в нашей компании.
• Используйте раствор РНКазы А для удаления РНК из образца плазмидной ДНК при ее выделении.
• Загрязнение плазмиды солями, которые могут остаться при пропуске этапа отмывки плазмиды при ее выделении, может привести к ухудшению качества секвенирования и уменьшению длины прочтения.

Продукты ПЦР

• Для постановки одной реакции секвенирования необходимо не менее 6 мкл раствора, содержащего очищенный целевой продукт, с концентрацией: 5-10 нг/мкл для фрагментов от 100 до 500 т.п.о., 10-30 нг/мкл для фрагментов от 500 до 1500 т.п.о. и 30-50 нг/мкл для фрагментов от 1 500 до 3 000 т.п.о.
• При очистке продукта ПЦР-реакции рекомендуем использовать коммерческие наборы реактивов или заказать очистку в нашей компании.
• Отправка кусочков геля, содержащих ПЦР-фрагментов, возможна, однако пересылка образцов в кусочках агарозного геля может приводить к их деградации.

Фрагментный анализ

• Обязательно указывайте в графе “примечание”, какие флуоресцентные красители вы использовали для наработки продукта.
• Для детекции мы добавляем к образцам size standart LIZ600, что позволяет детектировать образцы длиной до 600 букв.
• Есть вам нужен другой size standart, то вы можете предоставить его в отдельной пробирке (не смешивая его с образцами), предварительно обсудив этот вопрос по почте sequence@evrogen.ru.
• Мы принимаем для фрагментного анализа образцы, меченые одной или несколькими красками из списка (FAM, VIC, NED, PET) или красками (dR110, dR6G, dTAMRA, dROX) производства компании Thermo Fisher. Если вам требуется мультицветный фрагментный анализ, используйте, пожалуйста, коммерческие наборы, так как самостоятельная сборка фрагментов с помощью различных зондов может привести к отсутствию или неверному сигналу при проведении фрагментного анализа.
• Обратите, пожалуйста, внимание, что если вы хотите использовать зонды производства Евроген для наработки фрагментов, то наши приборы откалиброваны только под FAM. Использование зондов с другими красителями нашего производства не подходит для фрагментного анализа.