Очистка плазмид для секвенирования

I. Необходимые реагенты

1М Tris-HCl, pH 8.0
РНКаза А, лиоф.
10% SDS
10M NaOH
Ацетат калия
Уксусная кислота ледяная
Изопропанол
Вода (milliQ)
Реагенты для агарозного гель-электрофореза

II. Растворы

А. Раствор 1, ресуспендирующий буфер

1х PBS с добавлением РНКазы А, 0,5 мг/мл. При желании PBS может быть заменен 20-50 мМ Tris-HCl, pH 8,0

Б. Раствор 2, лизирующий буфер

1% SDS, 0,2M NaOH

В. Раствор 3, нейтрализующий буфер

3М ацетат калия (5М по ацетату).

Для приготовления раствора растворите 29,4 г ацетата калия в 60 мл воды, добавьте 11,5 мл ледяной уксусной кислоты и доведите объем до 100 мл.

III. Протокол очистки

1. Осадить клетки из 4-5 мл ночной культуры бактерий в микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл в режиме 6-10 тыс.об\мин. – 1 мин.

2. Тщательно избавиться от супернатанта, осадок интенсивно ресуспендировать в 250 мкл раствора 1.

3. Добавить 250 мкл раствора 2, осторожно перемешать, несколько раз переворачивая пробирку. Содержимое пробирки должно представлять собой гомогенную полупрозрачную жидкость вязкой консистенции. Процедура не должна занимать более 5 мин.

4. Добавить 350 мкл раствора 3, перемешать до образования творожистой хлопьевидной взвеси.

5. Отцентрифугировать при 10-12 тыс.об/мин, 10 мин.

6. Супернатант осторожно перенести в новую пробирку объемом 1,5 мл, избегая по возможности попадания взвешенных частиц дебриса в наконечник пипетки.

7. Добавить к супернатанту 700 мкл изопропанола, интенсивно перемешать на вортексе.

8. Отцентрифугировать при 10-12 тыс.об/мин, 10 мин; супернатант тщательно удалить, дополнительно импульсно открутить пробирку на микроцентрифуге или вортекс-центрифуге для удаления остатков изопропанола.

9. Добавить 1,0 мл 80% этанола, тут же удалить его, стараясь не утерять осадка. Дополнительно импульсно открутить пробирку на микроцентрифуге или вортекс-центрифуге для удаления остатков спирта.

10. Высушить содержимое пробирки при 40-45°С в течение 4-7 мин.

11. Добавить 50-70 мкл 5 мМ Tris-HCl, pH 8.0, проинкубировать содержимое 5-10 мин при 40-45°С. Перемешать на вортексе.

12. Оценить количество плазмиды на агарозном гель-электрофорезе относительно маркера масс или любого другого образца ДНК сходного размера и известной концентрации. Приемлемая концентрация плазмидной ДНК для секвенирования составляет не менее 50 нг/мкл. Данная методика выделения позволяет получать 5-15 мкг плазмидной ДНК в зависимости от размера плазмиды и ее копийности в бактериальных клетках.

ПРИМЕЧАНИЕ:

а) в данном случае следует с большой осторожностью относиться к измерениям концентрации плазмидной ДНК, выполненным любым инструментальным методом (флуори- или спектрофотометрия), поскольку в препарате ДНК, выделенному по приведенному выше протоколу, весьма значительно содержание РНК и белков, что абсолютно не отражается на качестве секвенирования;

б) хотя приведенный выше протокол позволяет получить плазмидную ДНК приемлемого для секвенирования качества, для большинства других методик: рестриктный анализ, приготовление зондов, трансфекция и т.п., требуется проведение дополнительной очистки, включающей в себя стандартную фенольную экстракцию с переосаждением этиловым спиртом.