Технология обнаружения редких аллелей с помощью мутационно-специфической ПЦР
Мутационно-специфическая ПЦР(мс-ПЦР) или Wild-Type Blocking PCR (WTB-PCR) - одна из наиболее эффективных технологий обнаружения редких аллелей, содержащих точечные мутации (единичные однонуклеотидные замены или небольшие делеции/инсерции).
Сутью технологии является введение в ПЦР-смесь дополнительных модифицированных олигонуклеотидов-блокаторов, комплементарных последовательности исследуемого региона ДНК "дикого типа", с достаточно высокой температурой плавления (Seyama et al., 1992; Orou et al., 1995; Dominguez et al., 2005). В ходе ПЦР эти олигонуклеотиды не отделяются от своей мишени на этапах отжига и элонгации, и таким образом препятствуют синтезу новых копий ДНК.
При наличии в исследуемом регионе хотя бы одной точечной мутации температура плавления блокаторов значительно снижается, и ПЦР проходит беспрепятственно.
Механизм действия Wild-Type Blocking PCR (WTB-PCR)
Стандартный анализ vs Инсайдер
Tot - Общая реакция;
Mut - Мутационно-специфическая реакция
Анализ мутаций в 15-м экзоне гена BRAF методом ИНСАЙДЕР: уточнение характера мутации и выявление микрометастазов в лимфатическом узле.
А, Б, В – первичная опухоль: меланома кожи; Г, Д, Е – подозрение на метастаз: лимфатический узел.А, Г – стандартный анализ (ПЦР + секвенирование): А – в меланоме выявлены две нуклеотидные замены - GAG наряду с нормой GTG, GAA наряду с нормой AAA; Г – в лимфатическом узле мутаций не выявлено.Б, Д – мутационно-специфическая ПЦР в режиме реального времени: Б – в меланоме выявлена мутация в концентрации около 50%; Д – в лимфатическом узле выявлена мутация в концентрации около 15%.В, Е – секвенирование продукта мутационно-специфической ПЦР: В – в меланоме выявлен сцепленный характер мутаций (нет сдвоенных пиков на месте нуклеотидных замен), Е – в лимфатическом узле выявлены мутации, идентичные мутациям в меланоме, верифицировано метастатическое поражение.
Анализ мутаций в 15-м экзоне гена BRAF методом ИНСАЙДЕР: уточнение характера мутации и выявление микрометастазов в лимфатическом узле.
А, Б, В – первичная опухоль: меланома кожи; Г, Д, Е – подозрение на метастаз: лимфатический узел.
А, Г – стандартный анализ (ПЦР + секвенирование): А – в меланоме выявлены две нуклеотидные замены - GAG наряду с нормой GTG, GAA наряду с нормой AAA; Г – в лимфатическом узле мутаций не выявлено.
Б, Д – мутационно-специфическая ПЦР в режиме реального времени: Б – в меланоме выявлена мутация в концентрации около 50%; Д – в лимфатическом узле выявлена мутация в концентрации около 15%.
В, Е – секвенирование продукта мутационно-специфической ПЦР: В – в меланоме выявлен сцепленный характер мутаций (нет сдвоенных пиков на месте нуклеотидных замен), Е – в лимфатическом узле выявлены мутации, идентичные мутациям в меланоме, верифицировано метастатическое поражение.
Список литературы
Dominguez PL, Kolodney MS.
Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens.
Oncogene. 2005 Oct 13;24(45):6830-4
pmid: 16116485 doi: 10.1038/sj.onc.1208832Orou A, Fechner B, Utermann G, Menzel HJ.
Allele-specific competitive blocker PCR: a one-step method with applicability to pool screening.
Hum Mutat. 1995;6(2):163-9
pmid: 7581400 doi: 10.1002/humu.1380060209Seyama T, Ito T, Hayashi T, Mizuno T, Nakamura N, Akiyama M.
A novel blocker-PCR method for detection of rare mutant alleles in the presence of an excess amount of normal DNA.
Nucleic Acids Res. 1992 May 25;20(10):2493-6
pmid: 1598207 doi: 10.1093/nar/20.10.2493