Фотоактивируемые флуоресцентные белки
Фотоактивируемые флуоресцентные белки обладают уникальной способностью менять спектральные характеристики под воздействием интенсивного света определенной длины волны. Это делает их удобным инструментом для мечения клеток, клеточных органелл и белков с целью последующего мониторинга их перемещений внутри живого организма.
После экспрессии белка, отдельные клетки, клеточные органеллы, содержащие флуоресцентный белок, или пул молекул химерного белка, включающего фотоактивируемый репортер и белок-мишень, облучают интенсивным светом определенной длины волны. В облучаемых объектах происходит фотоконверсия фотоактивируемого белка-репортера и изменяются его спектральные характеристики. После этого становиться возможным наблюдать за перемещениями "перекрашенных" объектов в режиме реального времени (Chudakov et al., 2004; Gurskaya et al., 2006; Chudakov et al., 2007).
Фотоактивируемые флуоресцентные белки могут быть также использованы для определения скорости деградации белков-мишеней в клетке. После экспрессии химерного белка, включающего фотоактивируемый репортер и белок-мишень, весь такой белок подвергается фотоконверсии. Полученный пул "перекрашенных" молекул отличается по спектральным характеристикам от новосинтезируемых молекул и изменение интенсивности его флуоресценции отражает процесс деградации белка (Zhang et al., 2007).
Таблица основных свойств фотоактивируемых флуоресцентных белков
Белок | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
До фото- | После фото- | До фото- | После фото- | До фото- | После фото- | |
Цвет флуоресценции | голубой | зеленый | нет | красный | нет | красный |
Максимум возбуждения (нм) | 400 | 490 | - | 562 | 580 | 580 |
Максимум эмиссии (нм) | 468 | 511 | - | 595 | 600 | 600 |
Квантовый выход | 0,20 | 0,23 | - | 0,38 | <0,001 | 0,07 |
К экст. (M-1cm-1) | 43000 | 47000 | - | 66000 | 123000 | 59000 |
Яркость* | 8,6 | 10,8 | - | 25,1 | - | 4,1 |
Яркость, % от EGFP | 26 | 33 | - | 75 | - | 12 |
Контраст | 2000 раз | 540 раз | 35-70 раз | |||
Свет активации | УФ (405 нм) | УФ (390-420 нм) | зеленый (530-560 нм) | |||
pKa | 4,3 | 6,1 | - | 5,3 | нет данных | нет данных |
Структура | мономер | мономер | тетрамер | |||
Агрегация | нет | нет | нет | |||
Токсичность для клеток | не детектируется | не детектируется | не детектируется | |||
Скорость созревания при 37°C | быстрая | быстрая | средняя | |||
Молекулярный вес (кДа) | 26 | 27 | 26 | |||
* Яркость – произведение коэффициента молярной экстинкции и квантового выхода флуоресценции, деленое на 1000.
К экст. – коэффициент молярной экстинкции.
Список статей
- Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA.
Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.
Nat Protoc. 2007; 2 (8):2024-32
pmid: 17703215 - Chudakov DM, Verkhusha VV, Staroverov DB, Souslova EA, Lukyanov S, Lukyanov KA.
Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking.
Nat Biotechnol. 2004; 22 (11):1435-9
pmid: 15502815 - Souslova EA, Chudakov DM.
Photoswitchable cyan fluorescent protein as a FRET donor.
Microsc Res Tech. 2006; 69 (3):207-9
pmid: 16538627 - Zhang L, Gurskaya NG, Merzlyak EM, Staroverov DB, Mudrik NN, Samarkina ON, Vinokurov LM, Lukyanov S, Lukyanov KA.
Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.
Biotechniques. 2007; 42 (4):446, 448, 450
pmid: 17489230 - Gurskaya NG, Verkhusha VV, Shcheglov AS, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Lukyanov S, Lukyanov KA.
Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.
Nat Biotechnol. 2006; 24 (4):461-5
pmid: 16550175