Генно-инженерные сервисы

Нормализация кДНК

Нормализация кДНК, конструирование нормализованных библиотек кДНК

- Цитирование

Нормализация кДНК - выравнивание концентрации различных типов молекул в образцах кДНК -- позволяет существенно снизить уровень высокопредставленных транскриптов в популяции кДНК и, таким образом, облегчает дальнейшее исследование транскриптома (широкомасштабное секвенирование, функциональный скрининг). В случае тотальной РНК прокариот нормализация позволяет значительно снизить уровень рибосомальной кДНК.

Евроген предлагает многоуровневый сервис, позволяющий получать нормализованные образцы кДНК, оптимизированные для различных технологий секвенирования, и библиотеки кДНК, обогащенные полноразмерными последовательностями, на основе тотальной или поли(А)+ РНК эукариот и тотальной РНК прокариот.

Синтез первой цепи и амплификация кДНК осуществляют с использованием технологии Mint или с рассеянной затравки (random primers). Для нормализации кДНК используют метод на основе дуплекс-специфической нуклеазы.

Клонирование нормализованных образцов кДНК, обогащенных полноразмерными последовательностями, осуществляют направленно по сайтам рестрикции SfiIA - SfiIB, SrfI - NotI или AscI - NotI в стандартный плазмидный вектор. Для контроля качества клонирования определяют процент рекомбинантов и средний размер вставки для 22 случайно отобранных клонов.

Для амплификации первичные библиотеки рассевают в 5 плашках (25x25 см, примерно 105 колоний на плашку); клоны смывают LB-средой с ампицилином; к амплифицированным библиотекам добавляют глицерин до конечной концентрации 17 %. Хранение полученных библиотек кДНК осуществляют при –70 °C.

Материалы, предоставляемые Заказчиком:

  • 3-5 мкг тотальной РНК эукариот
  • 1-2 мкг поли(А)+ РНК эукариот
  • 3-5 мкг тотальной РНК прокариот
  • Биологический материал (ткань, культура клеток) для выделения РНК

См. Требования к биологическим материалам

Описание работ:

КАТ.# ОПИСАНИЕ СТАРТОВЫЙ МАТЕРИАЛ ЦЕНА, РУБ. СРОК ВЫПОЛНЕНИЯ
Цены действительны на территории Российской Федерации и не включают доставку.
Приготовление нормализованной кДНК
CS010-1 Приготовление нормализованной кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями и фланкированной на 3'-конце Т-праймером, содержащем поли(Т) последовательность, разбитую несколькими С и G нуклеотидами. Использование такого праймера позволяет избежать проблем при секвенировании гомополимерных участков на 454 секвенаторе. Последовательности 5'- и 3'-адаптеров так же содержат ассиметричные сайты рестрикции SfiI. кДНК может быть использована для секвенирования на секвенаторах 454, Illumina и ABI SOLiD, направленного клонирования или других приложений. Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот 55 000 2-4 недели
CS010-1A Приготовление нормализованной кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями и фланкированной одинаковыми адаптерами.
Для синтеза кДНК используется Т-праймер, содержащий поли(Т) последовательность, разбитую несколькими С и G нуклеотидами. Использование такого праймера позволяет избежать проблем при секвенировании гомополимерных участков на 454 секвенаторе. 		Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот 50 000 2-4 недели
CS010-1B Приготовление нормализованной кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями и фланкированной адаптерами, содержащими ассиметричные сайты рестрикции SfiI. кДНК может быть использована для направленного клонирования или секвенирования на секвенаторах Illumina и ABI SOLiD. Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот 50 000 2-4 недели
CS010-1C Для синтеза кДНК используется Т-праймер, содержащий рестриктный сайт GsuI, позволяющий удалить поли(А)-последовательности кДНК перед секвенированием на 454 секвенаторе. Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот 50 000 2-4 недели
Конструирование нормализованных библиотек кДНК
CS011-2A Приготовление образцов нормализованной кДНК для направленного клонирования; лигирование образцов в плазмидный вектор. Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот 70 000 3-5 недель
CS011-2B Приготовление неамплифицированных нормализованных библиотек кДНК, содержащих приблизительно 100000 независимых клонов. Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот 85 000 4-6 недель
CS011-2C Приготовление амплифицированных нормализованных библиотек кДНК, содержащих приблизительно 400000 независимых клонов. Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот 85 000 4-6 недель
CS011-3A Приготовление неамплифицированных нормализованных библиотек кДНК + анализ эффективности нормализации путем секвенирования 90 случайных клонов из библиотеки. Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот 125 000 5-7 недель
CS011-3B Приготовление амплифицированных нормализованных библиотек кДНК + анализ эффективности нормализации с помощью секвенирования 90 случайных клонов из библиотеки. Тотальная или поли(А)+ РНК эукариот 125 000 5-7 недель
Дополнительные услуги
Выделение тотальной РНК из тканей +15 000 +1 неделя
Клонирование библиотек в нестандартный вектор договорная договорной
Анализ эффективности нормализации с помощью псевдо-Нозерн блота, ПЦР или ПЦР в реальном времени договорная +1-3 недели

Результат работы (передается Заказчику):

1. Амплифицированная ненормализованная кДНК (1 мкг)

2. Праймеры для амплификации кДНК

3. Амплифицированная нормализованная кДНК (2 мкг)

4. Нормализованная кДНК, лигированная в бактериальный вектор (для уровня CS011-2A)

5. Охарактеризованная нормализованная библиотека кДНК, согласно выбранному уровню сервиса

6. Очищенная плазмидная ДНК 90 клонов с результатами их секвенирования (для уровней CS011-3A, CS011-3B)

7. Отчет о проделанной работе


Результат нормализации кДНК из тканей человека.

(А) результат гель-электрофореза исходных (1) и нормализованных (2) образцов кДНК. (Б) Псевдо-Нозерн блот гибридизация этих образцов с [P32]-мечеными фрагментами генов глицеролфосфатдегидрогеназы (GPDH) и убикуитина С (UBC). М – маркер 1 kb DNA Ladder; эм. – эмбриональный; тонк. киш. – тонкая кишка.

Вниманию заказчика

В случае невозможности исполнения заказа, возникшей по вине заказчика (например, неверно предоставленной информации о нуклеотидной последовательности, присланных некачественных биологических материалах), произведенные услуги подлежат оплате в полном объеме.

Конфиденциальность

Евроген гарантирует сохранение конфиденциальности данных, полученных в процессе выполнения и обсуждения заказа.