Нормализация кДНК, конструирование нормализованных библиотек кДНК
 | Нормализация кДНК - выравнивание концентрации различных типов молекул в образцах кДНК -- позволяет существенно снизить уровень высокопредставленных транскриптов в популяции кДНК и, таким образом, облегчает дальнейшее исследование транскриптома (широкомасштабное секвенирование, функциональный скрининг). В случае тотальной РНК прокариот нормализация позволяет значительно снизить уровень рибосомальной кДНК. Евроген предлагает многоуровневый сервис, позволяющий получать нормализованные образцы кДНК, оптимизированные для различных технологий секвенирования, и библиотеки кДНК, обогащенные полноразмерными последовательностями, на основе тотальной или поли(А)+ РНК эукариот и тотальной РНК прокариот. Синтез первой цепи и амплификация кДНК осуществляют с использованием технологии Mint или с рассеянной затравки (random primers). Для нормализации кДНК используют метод на основе дуплекс-специфической нуклеазы. Клонирование нормализованных образцов кДНК, обогащенных полноразмерными последовательностями, осуществляют направленно по сайтам рестрикции SfiIA - SfiIB, SrfI - NotI или AscI - NotI в стандартный плазмидный вектор. Для контроля качества клонирования определяют процент рекомбинантов и средний размер вставки для 22 случайно отобранных клонов. Для амплификации первичные библиотеки рассевают в 5 плашках (25x25 см, примерно 105 колоний на плашку); клоны смывают LB-средой с ампицилином; к амплифицированным библиотекам добавляют глицерин до конечной концентрации 17 %. Хранение полученных библиотек кДНК осуществляют при –70 °C. |
Материалы, предоставляемые Заказчиком:
- 3-5 мкг тотальной РНК эукариот
-
1-2 мкг
поли(А)+ РНК эукариот - 3-5 мкг тотальной РНК прокариот
- Биологический материал (ткань, культура клеток) для выделения РНК
Описание работ:
| КАТ.# | ОПИСАНИЕ | СТАРТОВЫЙ МАТЕРИАЛ | ЦЕНА, РУБ. | СРОК ВЫПОЛНЕНИЯ |
|---|---|---|---|---|
| Цены действительны на территории Российской Федерации и не включают доставку. | ||||
 | ||||
| Приготовление нормализованной кДНК | ||||
| Приготовление нормализованной кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями и фланкированной на 3'-конце Т-праймером, содержащем поли(Т) последовательность, разбитую несколькими С и G нуклеотидами. Использование такого праймера позволяет избежать проблем при секвенировании гомополимерных участков на 454 секвенаторе. Последовательности 5'- и 3'-адаптеров так же содержат ассиметричные сайты рестрикции SfiI. кДНК может быть использована для секвенирования на секвенаторах 454, Illumina и ABI SOLiD, направленного клонирования или других приложений. | Тотальная или
| |||
| Приготовление нормализованной кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями и фланкированной
одинаковыми адаптерами.
Для синтеза кДНК используется Т-праймер, содержащий поли(Т) последовательность, разбитую несколькими С и G нуклеотидами. Использование такого праймера позволяет избежать проблем при секвенировании гомополимерных участков на 454 секвенаторе. | Тотальная или
| |||
| Приготовление нормализованной кДНК, обогащенной полноразмерными последовательностями и фланкированной адаптерами, содержащими ассиметричные сайты рестрикции SfiI. кДНК может быть использована для направленного клонирования или секвенирования на секвенаторах Illumina и ABI SOLiD. | Тотальная или
| |||
| Для синтеза кДНК используется Т-праймер, содержащий рестриктный сайт GsuI, позволяющий удалить поли(А)-последовательности кДНК перед секвенированием на 454 секвенаторе. | Тотальная или
| |||
| Конструирование нормализованных библиотек кДНК | ||||
| Приготовление образцов нормализованной кДНК для направленного клонирования; лигирование образцов в плазмидный вектор. | Тотальная или
| |||
| Приготовление неамплифицированных нормализованных библиотек кДНК, содержащих приблизительно 100000 независимых клонов. | Тотальная или
| |||
| Приготовление амплифицированных нормализованных библиотек кДНК, содержащих приблизительно 400000 независимых клонов. | Тотальная или
| |||
| Приготовление неамплифицированных нормализованных библиотек кДНК + анализ эффективности нормализации путем секвенирования 90 случайных клонов из библиотеки. | Тотальная или
| |||
| Приготовление амплифицированных нормализованных библиотек кДНК + анализ эффективности нормализации с помощью секвенирования 90 случайных клонов из библиотеки. | Тотальная или
| |||
| Дополнительные услуги | ||||
| Выделение тотальной РНК из тканей | ||||
| Клонирование библиотек в нестандартный вектор | ||||
| Анализ эффективности нормализации с помощью псевдо-Нозерн блота, ПЦР или ПЦР в реальном времени | ||||
Результат работы (передается Заказчику):
1. Амплифицированная ненормализованная кДНК (1 мкг)
2. Праймеры для амплификации кДНК
3. Амплифицированная нормализованная кДНК (2 мкг)
4. Нормализованная кДНК, лигированная в бактериальный вектор (для уровня CS011-2A)
5. Охарактеризованная нормализованная библиотека кДНК, согласно выбранному уровню сервиса
6. Очищенная плазмидная ДНК 90 клонов с результатами их секвенирования (для уровней CS011-3A, CS011-3B)
7. Отчет о проделанной работе
 |  | Результат нормализации кДНК из тканей человека. (А) результат гель-электрофореза исходных (1) и нормализованных (2) образцов кДНК. (Б) Псевдо-Нозерн блот
гибридизация этих образцов с [P32]-мечеными фрагментами генов глицеролфосфатдегидрогеназы (GPDH)
и убикуитина С (UBC).
М – маркер
|
|---|
Вниманию заказчика
В случае невозможности исполнения заказа, возникшей по вине заказчика (например, неверно предоставленной информации о нуклеотидной последовательности, присланных некачественных биологических материалах), произведенные услуги подлежат оплате в полном объеме.
Конфиденциальность
Евроген гарантирует сохранение конфиденциальности данных, полученных в процессе выполнения и обсуждения заказа.
