Eng | Ru

Определение пригодности образца для ПЦР

Определение производится путем оценки эффективной концентрации фрагментов ДНК соответствующей длины.

Эффективная концентрация - параметр количественной и качественной оценки ДНК, учитывающий концентрацию только тех фрагментов ДНК, которые пригодны для амплификации в ПЦР.

Значение эффективной концентрации может существенно отличаться от значений абсолютной концентрации, полученных методами, основанными на оптической спектрофотометрии или спектрофлуориметрии, поскольку последние не учитывают возможную фрагментацию молекул, химическую деградацию или модификацию, а также наличие ингибиторов ПЦР.
При одинаковой концентрации суммарной ДНК в разных образцах, степень ее деградации может сильно различаться. Более короткие фрагменты амплифицируются лучше длинных, поэтому при определении пригодности образцов ДНК для ПЦР следует учитывать длину ампликона в целевой реакции.

Определение эффективной концентрации проводится методом количественной ПЦР-РВ с использованием образцов геномной ДНК человека с известной концентрацией (стандартов). Для амплификации используются специфические праймеры на однокопийный участок в гене человека GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase). Накопление продуктов амплификации детектируется с использованием флуоресцентно-меченого зонда типа Taqman в режиме реального времени (см. схему).

Схема расположения праймеров и зонда.

После проведения амплификации (рис. А) стандартное ПО строит калибровочный график (рис. Б) по которому автоматически определяется эффективная концентрация ДНК в исследуемых образцах (рис. Г). Внутренний контроль, включенный в каждую реакцию, позволяет выявить образцы, содержащие ингибиторы ПЦР (рис. В).

А - кривые накопления ПЦР-продукта в канале FAM (измерительная реакция).

Синяя линия - стандарты ДНК и контроль без матрицы; красная - исследуемый образец.

Б - калибровочный график на основе стандартов ДНК (отмечены кружками).

Крестик - проекция Cq исследуемого образца на калибровочную кривую, по которой рассчитывается его концентрация.

В - кривые накопления ПЦР-продукта в канале HEX (внутренний контроль).

Зеленая линия - внутренний контроль в реакциях со стандартами ДНК и контролем без матрицы; красная - внутренний контроль в реакции с исследуемым образцом.

Г - таблица с вычисленными значениями эффективных концентраций.

Увеличить

© 2002-2018 Евроген.
Евроген, Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.